به طور کلی بیماری هایی که در نتیجه شرایط استرس اکسیداتیو در بدن ایجاد می شوند به دو گروه تقسیم می شوند:
۱) گروه اول شامل بیماری هایی هستند که در آن ها اکسایش تیول/ دی سولفید رخ می دهد و تلورانس گلوکز در آنها دچار آسیب و اختلال می گردد و شرایط استرس اکسیداتیو میتوکندریایی^[۴۰] نامیده می شود. (مثل سرطان و دیابت ملیتوس).
۲) گروه دوم شامل بیماری هایی هستند که توسط شرایط اکسیداتیو التهابی^[۴۱] شکل گرفته اند و فعالیت NADPH افزایش پیدا کرده است (مثل بیماری آترواسکلروز و التهاب مزمن) یا فعالیت زانتین اکسیداز/ محرک تشکیل گونه های واکنشگر اکسیژن در آنها افزایش یافته است (مثل آسیب های ناشی از ایسکمی / خونرسانی مجدد) (۴۰،۳۷).
میتوکندری جز اولین اندامک هایی است که در شرایط ایسکمی کلیوی تحت تأثیر قرار می گیرد. در شرایط ایسکمی تخلیه ATP باعث فعال شدن پروتئازها و فسفولیپازهایی می شود که به دنبال جریان خون سبب ‌آسیب های اکسیداتیو شده و نقش مهمی درپاتوژنز ARF دارند. این آسیب ها در سلول های اپیتلیالی مویرگ های توبولی و به خصوص درمدولای بیرونی رخ می دهد (۲۳،۲۲) .
در طول ایسکمی، با وجود فشار کم اکسیژن میزان متوسطی از گونه های واکنشگر اکسیژن تولید می شود که منبع آن میتوکندری است (۴۰). در طول خونرسانی مجدد هم تولید متوسطی از گونه های واکنشگر اکسیژن وجود دارد که احتمالاً از یک منبع متفاوت نسبت به دوره ایسکمی است و هنوز به طور دقیق مشخص نشده است.
تولید زیاد گونه های واکنش گر اکسیژن در طی I/R منجر به آسیب استرس اکسیداتیو و لیپیدپراکسیداسیون و در نتیجه آسیب های بافتی و آسیب به اندام ها می گردد (۴۱).
در طول ایسکمی با مصرف بیش از اندازه ATP در طی متابولیسم، پورین^[۴۲]، زانیتن^[۴۳] و هیپوزانتین^[۴۴] تجمع و تراکم می یابند که به محض ایجاد خونرسانی مجدد و ورود اکسیژن، بوسیله زانتین اکسیداز مقدار زیادی سوپراکسید تولید می شود. رادیکال سوپراکسید نیز توسط سوپراکسید دسموتاز (SOD) تبدیل به هیدروژن پراکسید می شود (۴۲).
بعد از I/R، رشته های F-action سلولهای ماهیچه صاف سازماندهی خود را از دست می دهند. و این تغییرات اسکلت سلولی، تخریب اتصالات سلولی، تخلیه ATP و مجاورت با عوامل اکسیدان مسئول افزایش نفوذپذیری پاراسلولار و نشت مواد از بستر عروقی به بافت می باشد که این شرایط باعث متورم شدن سلول های اندوتلیال و اختلال در جریان خون بواسطه فشرده کردن مویرگها و احتقان عروقی می شود (۲۳،۲۲). در طی I/R، بافت کلیه در معرض استرس اکسیداتیو قرار می گیرد. نوتروفیل ها نقش مهمی در القای آسیب کلیوی به دنبال I/R کلیوی دارند. و منبع دیگری برای ROS به حساب می آیند. نوتروفیل های فعال شده به سلول های اندوتلیال عروق متصل شده و پس از ورود به بافت توسط NADPH اکسیداز و میلو پروکسیداز^[۴۵] ،تولید ROS و یکسری سایتوکاین التهابی^[۴۶] می کنند که موجب آسیب به بافت می شود (۳۹، ۴۳).

بعد از تولید ROSدر شرایط ایسکمی/ خونرسانی مجدد، آسیب های اکسیداتیو و پراکسیداسیون رخ می دهد که این میزان آسیب ها بستگی به وجود آنتی اکسیدان ها در بدن دارد. در صورت وجود آنتی اکسیدان های کافی در بدن، آنتی اکسیدان ها به عنوان دهنده ی الکترون در مقابل رادیکال های آزاد عمل می کنند و جلوی آسیب های آنها را می گیرند. اما درصورت عدم وجود آنتی اکسیدان ها در بدن، ROS به پروتئین ها، لیپیدها و DNA سلولی حمله می کنند و موجب آسیب های جبران ناپذیر به بدن و سر منشأ بیماری های گوناگون می گردند (۵۴).
همان طور که در شکل نشان داده شده، حضور آنتی اکسیدان های مختلف در بدن مثل انواع ویتامین ها، گروهی از فلزات ، گروهی از آنزیم ها در برابر گونه های واکنشگر اکسیژن به عنوان جاروب کننده^[۴۷] و با واگذار کردن الکترون به آنها مانع حمله ی آنها به مولکول های سازنده بدن می گردند، اما در صورت عدم حضور آنها به پروتئین ها، DNA و لیپیدهای سلول ها آسیب وارد می شود که تحت عنوان استرس اکسیداتیو و لیپیدپراکسیداسیون (شامل واکنش ۱۴ به بعد در شکل می باشد) مطرح است. مالون دی آلدهید^[۴۸] (MDA)و ۴-هیدروکسی نان انال^[۴۹](HNE)، به عنوان محصول فرایند لیپیدپراکسیداسیون به عنوان شاخصی برای تعیین آسیب لیپیدپراکسیداسیون مطرح هستند و می توانند سرطان زا نیز باشند (۵۶ ، ۵۵).
هـ) کوئر ستین
کوئرستین (۳,۳’,۴’,۵,۷-Pentahydroxyflavone) یک ترکیب فعال با منشأ گیاهی است که بواسطه ی ساختار شیمیایی پلی فنلی دارای خاصیت رادیکال گیرندگی و آنتی اکسیدانی می باشد. در زمره فراوان ترین پلی فنل های مشتق شده از گیاهان محسوب می شود، اثر بخشی آن در کنترل و درمان بیماریهای از قبیل : هیپرتانسیون، ایسکمی قلبی، نارسایی احتقانی قلب ، هیپرلیپیدمی ، آترواسکلروز، اختلالات انعقاد خون، نوروپاتی دیابتی، نکروز بافتی، هیپرکلسیمی ناشی از دیابت و ضایعات بافتی ناشی از ایسکمی / خونرسانی مجدد مورد تأیید قرار گرفته است (۴،۵).
منابع کوئر ستین
کوئرستین در خیلی از میوه ها و سبزی ها یافت می شود . در کاهو، کلم بروکلی، گوجه فرنگی ، چای، توت ها، روغن زیتون، آب انگور قرمز، در پوست سیب و در پیاز به وفور یافت می شود. با وجودی که کوئرستین در خیلی از میوه ها و سبزی ها یافت می شود اما پیاز غنی ترین منبع به حساب می آید، به طوری که جذب این ماده در پیاز ۳۲% مؤثرتر و سریعتر از سایر منابع است و ۲۴ ساعت در بدن باقی ماند (۴۴، ۴۵).
۲- اثر کوئرستین در رابطه با رادیکالهای آزاد
مطالعات نشان داده اند که فلاونوئیدها دارای خواص فارماکولوژیکی گوناگونی هستند. کوئرستین به عنوان یک فلاونوئید آنتی اکسیدانی وضعیت ROS را در سلول ها تحت تأثیر قرار می دهد. طی مطالعاتی مشاهده شده است که کوئرستین دارای خواص محافظت کننده سلولی و بافتی در برابر عوامل استرس زا و اکسیداتیو ناشی از ROS دررت های دیابتی است. در واقع کوئرستین به عنوان یک فلاونوئید مهم و یک آنتی اکسیدان قوی باعث برداشت رادیکال های آزاد نظیر زانتین اکسیداز^[۵۰] و سوپراکسید^[۵۱] و کاهش استرس اکسیداتیو در حیوانات دیابتی می گردد (۴۷، ۴۶).
همچنین طی مطالعاتی مشاهده گردیده که کوئرستین بیشترین اثر را در کاهش کلسترول دارد. فلاونوئیدها با جلوگیری از اکسیداسیون LDL باعث هیپولیپیدمی در حالتInvivo می گردند (۴۸).
همچنین کوئرستین سلول های هپاتومای H₄ IIEرا در مقابل استرس اکسیداتیو ناشی از قرار گرفتن در معرض پراکسید هیدروژن محافظت می کند (۵۰).
۳- اثرات عروقی کوئرستین
مطالعات نشان داده اند که کوئرستین دارای یکسری اثرات عروقی نیز است. و این اثر وابسته به دوز است. کوئرستین پاسخ انقباضی القاء شده بر اثر اضافه نمودن آگونیست های غیر اختصاصی نظیر کلرورپتاسیم و اگونیست های اختصاصی نظیر نور آدرنالین^[۵۲] و فنیل افرین^[۵۳] را کاهش می دهد. همچنین در عروق هوایی و مقاومتی بدن تاثیر وازودیلاتوری (گشادکنندگی عروقی) بوجود می آورد. در این خصوص مشخص گردیده است که در موش های صحرایی طبیعی، اثر گشادکنندگی عروقی کوئرستین در غلظت های پائین وابستگی زیادی را به عوامل شیمیایی آزاد شده از سلولهای اندوتلیوم شامل نیتریک اکسید و پروستاگلاندین های باخاصیت گشاد کنندگی رگ نشان می دهد، ولی در غلظت های بالاتر این فلاونوئید با اعمال اثر مستقیم بر سلول های عضلانی صاف جداره عروق نیز می تواند اثرات گشادکنندگی عروقی خود را ایجاد نماید (۵۲، ۵۱).
۴- اثر ضد سرطانی کوئرستین
کوئرستین دارای اثرات ضد سرطانی نیز می باشد، آزمایش های گوناگون ثابت کرده اند که کوئر ستین به طور قابل توجهی اثر بازدارندگی رشد بر روی سلولهای سرطانی و تومور دارد. در شیمی درمانی در کنار سیس پلاتین^[۵۴] از کوئرستین نیز استفاده می شود. کوئرستین این عمل را از طریق چندین مکانیسم مولکولی انجام می دهد: اثر روی موتانت پروتئین P_53، اثر روی فاز G1 چرخه ی سلولی، اثر روی تیروزین کیناز به عنوان یک گیرنده پروتئینی سیگنال های رشد، اثر روی گیرنده ی استروژن (ERII)، اثر روی پروتئین شوک گرمایی^[۵۵] ، و اثر روی پروتئین Ras (54 ، ۵۳).
فصل دوم
این تحقیق بر روی ۳۰ رت نر با محدوده وزنی ۲۶۰ الی ۳۱۰ گرم از نژاد اسپراگ داولی انجام گردید. حیوانات قبل از آزمایش در شرایط نوری ۱۲ ساعت تاریکی و ۱۲ ساعت روشنایی و درجه حرارت ۱+۲۲ درجه سانتیگراد و دسترسی به مقادیر دلخواه آب و غذا نگهداری می شوند.
روش آماده سازی حیوانات :
۱.۱- روش تزریق کوئرستین:
کوئرستین به همراه حلال دی متیل سولفوکساید (DMSO) به مقدار mg/kg 30 (30 میلی گرم کوئرستین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن موش) با روش i.p. (تزریق داخل صفاتی) تزریق می شد.

2. 2. ۱- بیهوشی

حیوان با تزریق داخل صفاتی ۶۰mg/kgپنتوباربیتال سدیم بیهوش می گردید. در تمام طول آزمایش در صورت نیاز با تزریق داخل وریدی ۱/۵mgپنتوباربیتال سدیم بیهوشی ادامه می یافت.
۳.۱ - جراحی
پس از ثابت کردن حیوان بیهوش شده بر روی میز جراحی نواحی گردن شکم و کشاله ران سمت چپ تراشیده و تمیز می شد. با ایجاد یک برش طولی در ناحیه گردن و سپس کنار زدن فاشیا و غدد بزاقی به محض مشاهده عضله در برگیرنده نای با بهره گرفتن از پنس فیبرهای عضلانی کنار کشیده میشدند و با نمایان شدن نای و ایجاد یک برش بین غضروفی یک کانول پلی اتیلن با قطر مناسب جهت تراکئوستومی^[۵۶] درآن قرار داده می شد تا راه هوایی مطمئنی برای حیوان تأمین گردد و در طول آزمایش درصورت تجمع ترشحات در نای با استفاده ازسرنگ تمیز می گردید (تصویر ۱).
سپس در ناحیه کشاله ران سمت چپ با ایجاد یک برش تا بالای ران با دقت بافت های سطحی شکافته می شد تا شریان و ورید فمورال و عصب سیاتیک نمایان می شدند. پس از جدا کردن شریان و ورید فمورال از یکدیگر و تمیز کردن فاشیای روی آنها با کمک استریو میکروسکوپ^[۵۷] که بزرگنمایی لازم جهت کانول گذاری را فراهم می نمود یک کانول هپارینه (۲۰ واحد در میلی لیتر) با قطر مناسب (PE₅₀) در ورید فمورال قرار داده می شد که از طریق آن محلول نرمال سیلین توسط پمپ تزریق)تصویر۲) در تمام مدت آزمایش تزریق می شد. همچنین از همین کانول برای تزریق داخل وریدی داروی بیهوشی در طول آزمایش استفاده می شد. سپس یک کانول هپارینه با قطر مناسب (PE₅₀) در شریان فمورال قرار داده و به ترانسدیوسر فشار متصل می گردید و فشار خون شریانی در تمام مدت آزمایش توسط دستگاه بیولب^[۵۸](تصویر۳) ثبت می شد. گرفتن نمونه های خونی در طول آزمایش نیز از طریق همین کانول شریانی صورت می گرفت در مرحله بعد با ایجاد یک برش طولی برروی شکم و بازکردن آن یک برش کوچک هم روی مثانه داده می شد و یک کانول پلی اتیلن با قطر مناسب (PE₅₀) جهت جمع آوری ادرار در آن قرار داده و با بهره گرفتن از نخ به مثانه گره زده می شد (تصویر۴). سپس اطراف عروق کلیوی کاملاً تمیز شده و شریان و ورید کلیه در زیر استریومیکروسکوپ با دقت از یکدیگر جدا می شدند تا در زمان لازم بتوان با قرار دادن کلمپ به دور شریان های کلیوی آنها را مسدود نمود. پس از اتمام جراحی و قرار دادن احشاء در داخل شکم یک گاز آغشته به نرمال سیلین جهت جلوگیری از خشک شدن احشاء روی شکم قرار داده می شد. در تمام مراحل آزمایش درجه حرارت بدن حیوان توسط یک ترمومتر مقعدی اندازه گیری می گردید و با بهره گرفتن از لامپ هایی که در زیر و روی میز جراحی قرار داشتند در محدوده هایC ^o ۳۷±۱کنترل می شد (تصویر۵).
-پروتکل آزمایش
پس از اتمام جراحی دوساعت به حیوان استراحت داده می شد (Rest Period) تا عوارض ناشی از استرس جراحی برطرف گردد و نوسانات فشارخون شریانی به حداقل رسیده و حیوان در یک وضعیت پایدار قرار گیرد. بعداز اتمام دوره استراحت یک دوره کلیرانس نیم ساعته به عنوان دوره کنترل^[۵۹] انجام می شد. پس از آن شریان های کلیه به مدت ۳۰ دقیقه توسط کلمپ های غیر آسیب رسان مسدود می شدند و بلافاصله پس از برداشتن کلمپ ها یک دوره کلیرانس یک ساعته انجام می گردید.
در تمام دوره های کلیرانس ادرار در ظروف مخصوص از قبل وزن شده جمع آوری و فشار خون حیوان ثبت می گردید. ظروف حاوی نمونه های ادراری با ترازو وزن می شدند و با کم کردن وزن ظروف خالی از آن حجم ادرار جمع آوری شده بر حسب میلی لیتر بدست می آمد و سپس بطور موقت در یخچال نگهداری می شدند. در انتهای تمام دوره های کلیرانس و ایسکمی نمونه های خون شریانی از طریق کانول شریانی به حجم ۰/۷میلی لیتر با بهره گرفتن از سرنگ سرد هپارینه گرفته می شد و سریعاً پلاسمای آنها توسط دستگاه سانتریفیوژ جدا و درC -20نگهداری و گلبول های قرمز بعد از اضافه کردن نرمال سیلین با حجم برابر با پلاسمای جدا شده مخلوط گشته و مجدداً به حیوان تزریق می گردید. بعد از هر خونگیری و تزریق آن ۵ دقیقه جهت متعادل شدن دوباره فشار خون فرصت داده می شد و سپس دوره کلیرانس بعد آغاز می گردید. در انتهای آزمایش با گرفتن حجم زیاد و سریع خون حیوان معدوم می گردید.
تصویر ۱ – قرار دادن کانول پلی اتیلن جهت تراکئوستومی
تصویر ۲ – نمایی از پمپ تزریق مورد استفاده در طول آزمایش
تصویر ۳- نمایی از دستگاه بیولب مورد استفاده در طول آزمایش
تصویر ۴- کانول گذاری در شریان و ورید کلیه و مثانه
تصویر۵- بساط تحقیقاتی مورد استفاده در طول آزمایش
۲) خصوصیات دارو و نحوه تهیه آن
کوئرستین (۳,۳’,۴’,۵,۷-pentahydroxyflavone) با نام های دیگر Sophoret، Meletin، Cyanidenolon معرفی می شود. به صورت پودر زرد رنگ بوده و در آب نامحلول است.
فرمول مولکولی کوئرستین C₁₅H₁₀O₇ است و جرم مولکولی آن۳۰۲/۲۴ با میزان ترکیب ۵۹/۶۱ C درصد،۳/۳۳H درصد، ۳۷/۰۶O درصد می باشد. مزه الکلی آن خیلی تلخ است (۴۴).
در این تحقیق کوئرستین( شرکت سیگما ) به همراه حلال دی متیل سولفوکساید (DMSO) به مقدار ۳۰mg/Kg (30میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن موش) با روشi.p. (داخل صفاقی)، ۲ ساعت قبل از بیهوشی تزریق می گردید.
۴-گروه های آزمایشی
الف) گروه شاهد(Sham): در این گروه تمام مراحل جراحی و آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام می گردید، ولی شریان های کلیه طی آزمایش بسته نمی شدند. این گروه انفوزیون نرمال سالین با سرعت ۳ml/h در سراسر طول آزمایش دریافت می کردند.
ب) گروه تحت ایسکمی/خونرسانی مجددکلیوی(I/R):
در این گروه شریان های هردو کلیه به مدت نیم ساعت کلمپ و سپس باز می گردیدند و یک ساعت خونرسانی مجدد انجام می شد. این گروه انفوزیون نرمال سالین با سرعت ۳ml/h در طول آزمایش دریافت می کردند.