بافر شستشو ۱ (Wash Buffer I)

۸۰۰ µl

بافر شستشو ۲ (Wash Buffer II)

۳۰µl

بافر شوینده و پاک کننده (Elution Buffer)

در این روش، مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از نمونه خون بیمار را به میکروتیوپ ها منتقل کرده و با ۴۰۰ میکرولیتر از محلول بافر Lysis مخلوط و سپس به مدت ۲۰ ثانیه با بالاترین سرعت vortex می شود، تا یک سوسپانسیون یکنواختی ایجاد گردد، پس از آن ۳۰۰ میکرولیتر از بافر رسوب دهنده (Precipitation) را به محلول اضافه و مجددا به مدت ۵ ثانیه با سرعت vortex نموده می شود.
در این مرحله، سلول های گلبول های خونی متلاشی شده و محلولی از تمام مواد آلی و معدنی گلبول های سفید و قرمز به دست می آید. سدیم دودسیل سولفات (SDS) موجود در بافر لیز کننده، باعث حل شدن لیپیدها شده و پروتئیناز K آن باعث شکستن پروتئین ها و هیستون ها می گردد. مجموعه عوامل فوق باعث پاره شدن غشا سلول و هسته گردیده و رشته های نهایی DNA آزاد می شوند.
محلول فوق را با سمپلر به میکروتیوپ جدیدی که همراه با تیوپ مخصوص (Collction Tubes) موجود در کیت می باشد منتقل کرده و در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه (rpm) به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ می گردد و سپس Collction Tube که حاوی رسوب موادی غیر از DNA می باشد دور انداخته می شود و میکروتیوپ حاوی محلول به Collction Tube جدیدی انتقال داده می شود.
در این مرحله ۴۰۰ میکرولیتر بافر شستشو شماره ۱ را اضافه نموده و باrpm 13000 به مدت ۱دقیقه سانتریفیوژ کرده و مجدداً رسوبات غیر از DNA دور ریخته می شود، این کار با بافر شستشوی شماره ۲ ، دو مرتبه تکرار می گردد و در آخر پس از انتقال محلول حاوی DNA به Collction Tube جدید، ۳۰ میکرولیتر بافر Elution را اضافه و در دمای ۶۵ درجه سانتی گراد به مدت ۳ تا ۵ دقیقه در بن ماری انکوبه می گردد و سپس مجدداً محلول درrpm 13000 به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ می شود تا در نهایتDNA به صورت نوار یا توده سفید رنگی بدست آید. سپس نمونه های DNA برای نگهداری در مدت زمان طولانی تر به فریزر با دمای ۲۰- درجه سانتی گراد منتقل می شود.

۳-۳-۳- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده
برای انجام یک PCR موفق، باید DNA استخراج شده خالص و به مقدار و غلظت معین باشد. در بررسی کیفیت DNA نیازمند ۳ طول موج مختلف ۲۳۰ ، ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر می باشیم. برای بررسی حضور پپتید و عوامل دیگر از نسبت طول موج های ۲۶۰ و ۲۳۰ ، و برای تعیین خلوص DNA از طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ استفاده می گردد. DNA ، در طول موج ۲۶۰ نانومتر جذب بهتری دارد ]۴۲[. در این پژوهش برای بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده، از روش Nanodrop استفاده گردیده است.
۳-۳-۳-۱- تعیین غلظت DNA با روش Nanodrop
تعیین غلظت نمونه های DNA توسط UV اسپکتروفتومتر دو بیمی در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر انجام می پذیرد. بدین صورت که با تقسیم طول موج ۲۶۰ بر طول موج ۲۸۰ ، طبق فرمول زیر محاسبه می گردد:
۱OD = 50 µg/ml dsDNA
OD 260/280 ≥ ۱٫۸
عدد به دست آمده باید بالاتر از ۸/۱ باشد. چنانچه این عدد پایین تر از این مقدار باشد نشان دهنده وجود ناخالصی های پروتئینی در نمونه می باشد ]۲۹ و ۴۲[.
بدین منظور ابتدا یک میکرولیتر نمونه DNA را در جایگاه قرارگیری DNA گذاشته و غلظت آن توسط دستگاه محاسبه و خوانده شد، این عدد همان طور که ذکر شد باید در بهترین حالت ۸/۱ باشد تا صحت کار تأیید گردد. برای مثال OD یک نمونه از خون های استخراج شده حدود ۸۶/۱ می باشد و غلظت DNA محاسبه شده آن µg/ml93 به دست آمد که نشان دهنده عدم وجود ناخالصی می باشد.
۳-۳-۴- واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR )
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، یک روش تکثیر DNA در خارج از محیط زنده، نخستین بار در اواسط دهه ۱۹۸۰ گزارش گردید. PCR به دلیل ساده بودن، نوعی تکنیک رایج با گستره وسیعی از کاربردهای متفاوت محسوب می گردد که اساساً دارای ۳ مزیت عمده: سرعت بالا، حساسیت زیاد و قدرت می باشد ]۱[.
حساسیت این روش، تکثیر مقادیر جزیی از DNA هدف را میسر می سازد. قدرتمند بودن روش PCR نیز بدین معنی است که اغلب، تکثیر DNA موجود در سلول های به شدت تخریب شده در محیطی که جداسازی DNA از طریق روش های استاندارد را دشوار می سازد با بهره گرفتن از PCR امکان پذیر می باشد ]۱[.
اساس روش PCR، شامل سنتز انواعی از توالی های الیگو نوکلئوتیدی است که به عنوان پرایمر جهت سنتز DNA جدید در توالی های هدف معین موجود در DNA آغازین عمل می کنند. یعنی تکثیر انتخابی توالی های هدف است. PCR، شامل مجموعه ای از چرخه های متشکل از سه واکنش متوالی بوده که در دماهای متفاوت انجام می پذیرد ]۲۱[. مراحل پایه ای و تکراری PCR به ترتیب شامل موارد زیر می باشند :
۱- واسرشت شدن ( Denaturation ) : مخلوط تا دمای ۹۴ درجه سانتی گراد گرم می شود. در این دما پیوندهای هیدروژنی بین جفت نوکلئوتیدها که مولکول دو رشته ای DNA را بهم متصل نگه داشته، شکسته شده و در نتیجه مولکول واسرشته می گردد.
۲- اتصال پرایمرها ( Annealing ) : در این مرحله دمای مخلوط تا دمای ۵۶ -۵۰ درجه سانتی گراد پایین می آید. در این مرحله امکان اتصال ۲ رشته مولکول DNA بهم وجود دارد، اما به دلیل وجود تعداد زیادی از الیگونوکلئوتیدهایی با توالی کوتاه، به نام “پرایمر” امکان اتصال دو رشته DNAاغلب امکان پذیر نیست و پرایمرها از طریق رابطه مکملی به مکان های خاصی از DNA متصل می شوند.
۳- تکثیر DNA جدید (or Extension Synthesis ): در مرحله سوم دما مجددا افزایش می یابد، البته تا ۷۴ درجه سانتی گراد. این دما برای فعالیت تگ DNA پلیمرازهای (Taq DNA Polymerase) موجود در مخلوط مناسب می باشد، تا بتوانند به انتهای پرایمرها متصل و سنتز DNA جدید را از طریق ایجاد رابطه مکملی باDNA الگو آغاز نمایند.
در پایان این مرحله, ۴ رشته DNA به دست می آید و مجددا دما به ۹۴ درجه سانتی گراد افزایش می یابد و این مراحل همان طور که در شکل ۳-۱ نشان داده شده است به صورت تکراری ادامه دارد تا رشته های بیشتری سنتز و تولید شوند ]۲۱[.

شکل۳-۱- مراحل PCR
۳-۳-۴-۱- طراحی پرایمر
پرایمرها کلید موفقیت یا عدم موفقیت در فرایند PCR هستند. اگر به درستی طراحی شوند، می توانند به موقعیت اختصاصی تعریف شده، متصل شوند و تولید DNA هدف را با صحت و دقت، امکان پذیر سازند. “پرایمر” یک رشته و توالی کوچکی از اسیدهای نوکلئیک است که به عنوان آغازگری برای سنتزDNA طراحی می گردد. از آنجایی که DNA دو رشته ای است دو پرایمر نیاز است که در دو انتهای ژن هدف قرار گرفته شود و از ناحیه ‘ ۳ آن تکثیر DNAآغاز می گردد (شکل ۳-۲). یک پرایمر باید با رشته الگوی خود در محل اتصال، مکمل باشد تا طبق رابطه مکملی بازهای آلی، هیبریداسیون اتفاق بیافتد، به طوری که انتهای ‘۳ پرایمرها، به طرف یکدیگر قرارگیرند.
شکل ۳-۲- یک جفت پرایمر طراحی شده در ۲ انتهای ژن
اولین و مهم ترین نکته ای که در طراحی هر پرایمر باید بدان توجه داشت، اندازه ی قطعه پرایمر است. اگر قطعه طراحی شده خیلی کوچک باشد، اختصاصیت اتصال آن به DNA هدف کاهش می یابد و ممکن است به هرقسمتی که تقریباً مکمل باشد متصل شود و اگر بیش از حد بزرگ باشد سرعت PCR را کاهش می دهد. از آنجایی که کارایی فرایند PCR با توجه به تعداد تکثیرهایی که در زمان تعیین شده تولید می کند، محاسبه می گردد، پس قطعه طویل پرایمر این سرعت را کاهش و کارایی PCR را پایین می آورد. بنابراین بهترین اندازه برای پرایمر، ۲۰ تا ۳۰ نوکلئوتید می باشد ]۲۱ و ۲۲[.
در این مطالعه ابتدا توالی مربوط به ژن ADRβ۲ از پایگاه اطلاعاتی NCBI^[1] دریافت شد. پرایمرهای ژن مربوطه که تنها حاوی ۱ اگزون می باشد با بهره گرفتن از نرم افزار PrePrimer و Primer3 طراحی شد که حاوی ۱۹ نوکلئوتید است. این نرم افزارها پرایمر را از نظر تشکیل پرایمر- دایمر یا خود مکملی بررسی کرده و مناسب ترین توالی را در اختیار کاربر قرار می دهد. سپس پرایمرها توسط شرکت “دانا ژن پژوه” ساخته شد. پرایمرهای استفاده شده در جدول زیر آورده شده است.
جدول ۳-۲- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای PCR

نام اگزون

اندازه قطعه