۹۱/۰

۸۶/۶

۱۵/۷

۳۴/۹

۱۲/۱

( ۵ %) LSD

به هر حال، پس از آلودگی باکتریایی، پینه های تشکیل شده در غلظت ۱۵۰ میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ یک افزایش مقاومت در ریزنمونه های برگ مشاهده شد (جدول ۴-۳).

بدون آلودگی باکتریایی تشکیل شاخساره در غلظت ۵۰ میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالی که برای رقم ’Panamera‘ این اتفاق در غلظت ۱۰۰ میلی گرم در لیتر کانامیسین صورت گرفت. به هر صورت، پس از آلودگی باکتریایی، شاخساره ها حتی در غلظت ۱۰۰ میلی گرم در لیتر کانامیسین برای هر دو رقم تشکیل شدند (جدول۴-۳).
نتایج تشکیل پینه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘بیش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کانامیسین مقاوم است. اگر چه پینه ها روی محیط محتوی بیش از ۵۰ میلی گرم در لیتر کانامیسین تشکیل شدند، ولی آن ها به طور معمول در مقایسه با محیط بدون کانامیسین کوچکتر و قهوه ای رنگ بودند. به نظر می رسد آلودگی باکتریایی تشکیل پینه و شاخساره را به تعویق می اندازد.
این بررسی نشان داد که آلودگی باکتریایی مقاومت ریزنمونه های برگ به مواد گزینشی را افزایش می دهد. اثرهای بازدارنده پایین کانامیسین در این بررسی ممکن است به سبب اتصال ویژه آنتی بیوتیک به مواد جامد کننده باشد.
ترکیبات انگیزاننده مختلف در صورت مایه زنی با عامل بیماری زا تولید می شوند. افزایش مقاومت به مواد گزینشی در صورت آلودگی باکتریایی در این بررسی ممکن است مرتبط با انگیزش پروتئین های مرتبط با عامل بیماری زا در ریزنمونه های برگ باشد. نتایج ما با نتایج سونگ زنگ و همکاران (zhang et al, 2004) همسویی دارد.

۴-۲-۲- تولید گیاهان تراریخت

­
در آزمایش های انجام شده از Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 دارای پلاسمید pBI 121 حامل ژن گزارشگر بتاگلوکورونیداز (uidA) تحت کنترل پیشبر CaMV35S ویروس موزاییک کلم گل و ژن نشانگر گزینشگر npt П برای انتقال ژن به دو رقم میخک استفاده شد.
در این پژوهش از ریزنمونه های برگ و پینه برای انجام انتقال ژن استفاده شد. برای کاهش تعداد شاخساره های گریخته اندازه ریزنمونه های اولیه کوچک در نظر گرفته شد که این عمل اجازه می دهد آن ها بیشتر در برابر مواد گزینشگر در محیط کشت باشند و همچنین روش گزینش به گونه ای تغییر یافت که تماس بین ریزنمونه ها و محیط خیلی زیاد باشد. در ضمن پس از انتقال گیاهان تراریخت به خاک اختلاف مورفولوژیک با گیاهان کنترل نشان ندادند.
پس از گذشت ۸ تا ۱۰ هفته از مایه کوبی ریزنمونه های برگ با باکتری شاخساره هایی به طول چند میلی متر پدیدار شدند (نگاره ۱-۴). پس از واکشت آن ها زمانی که شاخساره ها به طول چند سانتی متر رشد کردند از آن ها برای استخراج DNA و انجام PCR و همچنین آزمون رنگ آمیزی هیستو شیمیایی GUSاستفاده شد.

نگاره ۱-۴- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت ۸ تا ۱۰ هفته از مایه کوبی برای رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ .

۴-۲-۳- تأیید گیاهان تراریخت با سنجش فعالیت GUS

رنگ آمیزی شاخساره ها یا پینه های ایجاد شده نشان داد که شاخساره ها و پینه ها از نظر فعالیت GUS مثبت بودند که این امر نشان می دهد ژن GUS الحاق یافته تحت کنترل پیشبر S35 ویروس موزاییک کلم گل (P35S) در سطوح بالایی بیان می شود. نگاره ۲-۴ بیانگر این موضوع است.
نگاره ۲-۴- سنجش ژن GUS در رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ .
­
نگاره ۳-۴- سنجش ژن GUS در رقم مینیاتور ’Panamera ‘.

۴-۳- آنالیز PCR

در رقم ’Rendz-Vous‘ وجود باند در bp 425 در نمونه های گیاهان تراریخت (چاهک های ۲ تا ۷) پیوستن ژن GUS را ثابت نمود. هیچ باندی در نمونه های نا تراریخت (چاهک های ۸ و ۹) دیده نشد و در رقم ’Panamera‘وجود باند در bp 425 در نمونه های گیاهان تراریخت (چاهک های ۲،۳ و ۴) پیوستن ژن GUS را اثبات نمود.
۶
M
۳
۴
۹
۸
۷